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1．在每毫升zui后的噬菌体悬液（例如来自实验方案13．11）中，加入0．45g氯化铯，充分混匀至溶解。2．用吊桶式转头（或与其相当的型号）离心溶液，15℃17h，噬菌体将浓缩在组分1和组分2中（。组分1的浓度较高，但组分2的体积较大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取这些组分。如果是*次使用本实验方案，那么先收集所有条带并分别对其检测将是明智之举。3．将收获的溶液对PBS透析过夜。4．通过感染大肠杆菌DH5cF，或TGl滴定各个不同组分中噬菌体，并保存滴度zui高的组分。通常，噬菌...
从噬菌体抗体文库中分离抗原特异性抗体，是通过让噬菌体进入到在抗原上进行的重复性选择循环来实现的。理想情况下，仅需l轮选择即可完成。但事实是，丝状噬菌体常常非特异性地结合到支持物表面，从而限制了每轮所能获得的富集水平。实际上，需要2～5轮的选择。现在已设计了许多各自不同的选择方法；其中包括在固相支持物上包被抗原进行生物淘选，使用免疫亲和层析注或BIAcore传感芯片，用生物素化抗原选择E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳动物E403细胞、组织培养细胞E41-4...
1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃过夜。PBS中10ug／m1的浓度是包被抗原的标准浓度。但有时需要更高的浓度或者不同的包被缓冲液（比如碳酸盐缓冲液）。2．弃去抗原液并用PBS洗涤板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封闭每个板孔，37℃孵育2小时。4．用PBS洗涤板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗体的培养基上清，用移液器反复吹吸混匀，室温孵育1小时。7．弃去溶液，用PBS／Tween洗涤板孔3次，再用PBS洗涤3次...
噬菌体展示可使抗体亲和力提高到1000倍以上。很典型的起始点是自噬菌体抗体文库中分离特异性抗体。为完成亲和力的成熟（亲和力的增加），要对抗体序列进行多样化；突变基因文库展示在丝状噬菌体表面上，并在抗原上选择具有更高亲和力的结合性抗体。尽管整个过程已相当清晰，但研究者在进行体外亲和力成熟前必须明确：提高特定抗体亲和力将会产生预期的生物学效果。当尝试用抗体中和循环中的毒素或生长因子时，更高的亲和力就显得特别重要。在此情况下，抗体与抗原都分布于同样的区域，能使抗原抗体的相互作用达到...
利用含有目标受体的复杂混合物，对噬菌体展示肽文库进行筛选。这适用于许多令人感兴趣的生物体系，如血清、脑脊液及其他生物性体液和细胞或组织表面等。在此情况下，目标就是要鉴定出结合于特定受体分子或结合于一组具有特定性质的受体上的多肽。我们及他人都在致力于鉴定那些可与疾病特异性相关的抗体（疾病特异性抗体，DS-Ab）相结合的多肽。这里我们所描述的方法，是用来鉴定丙型肝炎感染（HCV）特异性相关抗体的相应配体。HCV是一种性慢性肝病的主要病因。利用来自HCV感染者和非感染者的血清（以下...
实验过程的zui后步骤是以合成每一个结合性或定位性的多肽来作为荧光标记多肽[典型的荧光素或若丹明（rhodamine）]，然后在静脉注射后测定其生物分布的。荧光标记也使得多肽能在随后的没有任何修饰的受体分离中被使用：可以使用荧光多肽在基于细胞的表达性克隆系统中分类受体阳性的细胞，并且也可以通过高亲和性的鼠抗荧光素单抗体的使用把荧光多肽直接固定到固体基质上。在有偶合剂（couplingreagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情况下，加入异硫氰酸荧光素I（f...
1．使用来自筛选出的噬菌?？寺〉哪０鍰NA，以及包含与AP融合表达载体的克隆位点相对应的限制性酶切位点的寡核苷酸引物，进行PCR反应。2．通过琼脂糖凝胶电泳检测正确大小的扩增产物。选择相应方法对PCR产物进行纯化。3．用对应于克隆位点的限制性内切酶消化PCR产物，使用标准的方法将此产物连接到相同酶切后的AP融合蛋白表达载体中。4，通过标准的方法将连接产物转化入大肠杆菌中，铺到含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。挑取单克隆，利用标准的方法（如限制性酶切或PCR）鉴定是否有...
麦芽糖结合蛋白ELISA的方法与以前论文所述一致[1Sj，除了从大肠杆菌中释放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我们发现，使用商业性的去垢剂（Pierce公司的B-PER抽提试剂）较溶菌酶能更简单有效地裂解细菌细胞。3ml培养基中的经诱导的细胞先通过沉降，再通过含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重悬。于室温下放置20分钟后，离心5分钟以除去细胞碎片，将上清转移到一个新的管中。裂解物于一70~0冻存，当用于ELISA反应时按1：50稀释。在几个实验项目中，我们发现...
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